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看完這些就知道超微量分光光度計在核酸定量上的應用了

更新時(shí)間:2020-08-04      點(diǎn)擊次數:1454
  超微量分光光度計是一類(lèi)很重要的分析儀器 ,無(wú)論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫藥、環(huán)境檢測、冶金等現代生產(chǎn)與管理部門(mén) ,紫外可見(jiàn)分光光度計都有廣泛而重要的應用。
 
  超微量分光光度計已成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長(cháng)濃度的定量。
 
  那么下面讓我們來(lái)了解一下超微量分光光度計在核酸定量上的應用吧。
 
  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。
 
  核酸的高吸收峰的吸收波長(cháng)260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸,事先要選擇對應的系數。
 
  如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。
 
  測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。
 
  測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。
 
  事實(shí)上,分光光度計的設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的準確度。
 
  這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì )導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液。
 
  樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。
 
  為了大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。
 
  從而意味著(zhù)樣品的濃度不能過(guò)低,或者過(guò)高(超過(guò)光度計的測試范圍)。后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;
 
  混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;
 
  不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項。
 
  除了核酸濃度,分光光度計同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。
 
  純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。
 
  A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。
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